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以下故障排除指南旨在解釋免疫細胞化學/免疫熒光 (ICC/IF) 染色中觀察到的常見問題的原因和可能的解決方案。
沒信號
抗體應用
增加一抗或二抗的濃度或孵育時間。
透化緩沖液
使用適當?shù)耐富噭┻M行靶蛋白的定位。 Triton 去污劑對于線粒體或核蛋白是必需的，但會溶解外膜并破壞正確的膜定位。
增加孵育時間或洗滌劑濃度。
細胞固定
過度固定可能會導致表位掩蔽。減少固定劑的時間或濃度。
抗體相容性
通過檢查物種反應性來確認您的一抗和二抗是否兼容。
確認抗體可用于蛋白質(zhì)處于天然構(gòu)象的測定。
通過使用陽性對照初級濾光片，確保次級濾光片正常工作并與顯微鏡的濾光片組兼容。
目標可用性
使用已知表達目的蛋白的過表達測定或陽性對照細胞系。
細胞干燥
如果細胞干燥，熒光信號將會丟失。環(huán)蓋玻片涂有指甲油。
細胞活力
在開始染色程序之前確認細胞活力。
顯微鏡調(diào)整
增加相機的曝光時間。
背景
抗體濃度
降低一抗/二抗的濃度。
阻塞
增加封閉緩沖液中的孵育時間或血清濃度。使用封閉緩沖液稀釋一抗和二抗。
抗體應用
始終將一抗在 4° C 下孵育過夜。室溫孵育會增加非特異性結(jié)合并導致更高的背景。
通過在沒有初級的情況下進行測定，確認次級不會與細胞發(fā)生交叉反應。
污染文物
確保載玻片清潔且無灰塵。緩沖液應新鮮配制，以防止微生物污染。
洗滌
增加洗滌次數(shù)。對板進行非常溫和的攪拌。
增加 PBS-T 中 Tween 的濃度。
光譜重疊
如果對細胞進行雙重或三重標記，請確認二級細胞不會重疊到相同的光譜范圍內(nèi)
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