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花青染料是在兩個帶有離域電荷的氮原子之間含有聚次甲基橋的分子：
由于其結構，花青具有很高的消光系數，通常超過 100,000 Lmol -1 cm -1。不同的取代基可以控制發色團的特性，例如吸光度波長、光穩定性和熒光。例如，吸光度和熒光波長可以通過選擇聚次甲基橋長度來控制：較長的花青具有較高的吸光度和發射波長，直至近紅外區域。
許多花青染料已用于生命科學應用。一系列噻唑和惡唑染料已被用作 DNA 和蛋白質結合染料（如 TOTO、YOYO、Stains All 等）。但生命科學研究中受歡迎的花青染料是由卡內基梅隆大學的 Alan Wagoner 及其同事于 20 世紀 90 年代初推出的。這些染料是花青染料吲哚青綠 (ICG) 的改良版，自 20 世紀 70 年代起用于血管造影，它們都含有兩個位于聚次甲基鏈側的假吲哚環。人們發現這些染料與生物分子表現出低非特異性結合，并且由于其巨大的消光系數和良好的量子產率而具有明亮的熒光。可以從 Lumiprobe 購買，用于研究和商業用途，作為各種反應性衍生物，例如用于點擊化學的NHS 酯、馬來酰亞胺、疊氮化物以及其他衍生物。
花青染料有兩種：非磺化花青和磺化花青。對于許多應用來說，它們是可以互換的，因為它們的光譜特性幾乎相同。磺化和非磺化染料均可用于標記 DNA 和蛋白質等生物分子。染料之間的區別在于它們的溶解度：磺基染料是水溶性的，并且它們在水性環境中標記時不使用有機共溶劑。它們在水中不易聚集。在某些情況下，需要其中一種類型的花青（請參閱下面的“磺化花青與非磺化花青"部分）。
可用的非磺化染料包括 Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7 和 Cy7.5。 Cy ®代表“花青"，第一個數字表示假吲哚基團之間的碳原子數。 Cy2 是一種惡唑衍生物，而不是吲哚寧，是該規則的一個例外。苯并稠合花青添加后綴 0.5。結構的變化可以改變分子的熒光特性，并用多個熒光團覆蓋可見光和近紅外光譜的最重要部分。
大多數非磺化花青衍生物（酰肼和胺的鹽酸鹽除外）的水溶性較低。當這些分子用于生物分子標記時，必須使用有機共溶劑（5-20％的DMF或DMSO）才能有效反應。花青染料應首先溶解在有機溶劑中，然后添加到生物分子（蛋白質、肽、氨基標記的 DNA）在適當的水性緩沖液中的溶液中。當綴合有效發生時，染料會在沉淀之前發生反應。
非磺化花青的熒光性質對溶劑和周圍環境的依賴性很小。非磺化花青染料的吸光度和熒光光譜繪制如下。
磺化花青包含額外的磺基，其有利于染料分子在水相中的溶解。帶電荷的磺酸基團減少染料分子和重度標記的綴合物的聚集。
目前可用的磺化花青包括磺基-Cy3、磺基-Cy5和磺基-Cy7。
磺化花青具有高度水溶性。使用這些試劑進行標記不需要有機共溶劑。
磺化和非磺化花青表現出非常相似的熒光特性。然而，標簽協議存在一些值得注意的差異。非磺化花青在使用前必須溶解在有機共溶劑（DMF 或 DMSO）中，并添加到目標分子在水性緩沖液中的溶液中。對于 Cy3、Cy5、Cy7，建議的共溶劑體積應為 10%，對于 0.5 對應物，建議的共溶劑體積應為 15%。磺基花青試劑可在純水溶液條件下使用。純化方面也存在差異：當使用水或水性緩沖液透析進行純化時，必須使用磺基花青以實現有效去除未反應的染料物質。磺基和非磺基花青的反應可以通過凝膠過濾、色譜法（HPLC、FPLC、離子交換）或電泳進行純化。
磺化和非磺化花青可互換用于標記許多類別的目標，包括：
可溶性蛋白質，可耐受有機共溶劑的添加
抗體（使用 5-10% DMSO/DMF）
DNA和寡核苷酸
肽
許多小分子
使用相似的磺化和非磺化試劑（例如磺基-Cy5 和 Cy5）產生的綴合物的熒光特性非常相似，并且可以與各種熒光儀器一起使用。
磺化花青必須用于：
被 DMF 或 DMSO 變性的敏感蛋白
通過透析純化時的蛋白質綴合
水溶液中的納米顆粒
不溶性或疏水性蛋白質
非磺化花青必須用于：
有機介質（二氯甲烷、乙腈）中的反應
Lumiprobe 提供以下花青產品。
| Fluorophore | Reactive form |
|---|---|
| sulfo-Cy3 | NHS ester maleimide azide alkyne carboxylic acid |
| sulfo-Cy5 | NHS ester maleimide azide alkyne carboxylic acid |
| sulfo-Cy7 | NHS ester azide amine carboxylic acid |
| Cy3 | NHS ester maleimide azide alkyne hydrazide amine carboxylic acid |
| Cy3.5 | NHS ester azide carboxylic acid |
| Cy5 | NHS ester maleimide azide alkyne hydrazide amine carboxylic acid |
| Cy5.5 | NHS ester maleimide azide alkyne hydrazide amine carboxylic acid |
| Cy7 | NHS ester maleimide azide alkyne hydrazide amine carboxylic acid |
| Cy7.5 | NHS ester maleimide azide alkyne hydrazide amine carboxylic acid |
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