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PI單染的原理主要是根據(jù)細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞、亞細(xì)胞和分子水平發(fā)生的特征性變化。這些變化包括細(xì)胞核的變化、細(xì)胞器的變化、細(xì)胞膜成分的變化和細(xì)胞形態(tài)的變化，其中細(xì)胞核的變化很有特征。
熒光染料PI（碘化丙啶）是一種可以對DNA進(jìn)行染色的核染色試劑。它常用于細(xì)胞凋亡檢測。英文全稱是Propidium Iodide。它是一種溴化乙錠類似物，嵌入雙鏈 DNA 后會發(fā)出紅色熒光。雖然 PI 不能穿過活細(xì)胞膜，但它可以穿過受損的細(xì)胞膜并對細(xì)胞核進(jìn)行染色。 PI 通常與 Calcein-AM 或 FDA 等熒光探針一起使用，以同時對活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行染色。 PI-DNA復(fù)合物的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為535 nm和615 nm。
外觀：紅棕色粉末儲存條件：-20℃
1、細(xì)胞核的變化：由于凋亡細(xì)胞細(xì)胞核的變化，導(dǎo)致各種染色體熒光染料對凋亡細(xì)胞DNA的染色性發(fā)生改變。研究表明，用各種染色體熒光染料對固定的凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色會降低 DNA 染色能力。許多學(xué)者將 DNA 染色性的降低視為凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一。
2.光散射特性：凋亡細(xì)胞形態(tài)的變化影響其光散射特性。在流式細(xì)胞儀上，前向散射光與細(xì)胞的大小有關(guān)，而側(cè)向散射光反映了細(xì)胞內(nèi)光的折射，與細(xì)胞內(nèi)顆粒的數(shù)量有關(guān)。細(xì)胞凋亡時，細(xì)胞收縮，體積變小，因此前向散射光減少。這一特征通常被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的特征之一。另外，由于細(xì)胞凋亡時染色體的降解和核破裂的形成，細(xì)胞內(nèi)顆粒常增多，故凋亡細(xì)胞的側(cè)向散射光常增多。細(xì)胞壞死時，由于細(xì)胞腫脹，前向散射光增加；細(xì)胞壞死時側(cè)向散射光也增加，因此根據(jù)前向散射光和側(cè)向散射光可以區(qū)分凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。但需要注意的是，根據(jù)前向散射光和側(cè)向散射光判斷凋亡細(xì)胞的可靠性，很大程度上受檢測細(xì)胞形態(tài)的均勻性和核質(zhì)比的影響。因此，在某些淋巴細(xì)胞凋亡中，通過光散射特性檢測細(xì)胞凋亡的可靠性較好，但在腫瘤細(xì)胞凋亡中，其可靠性較差。基于光散射特性檢測凋亡細(xì)胞的主要優(yōu)點(diǎn)是，光散射特性可以與細(xì)胞的表面免疫熒光分析相結(jié)合，以區(qū)分經(jīng)過這些特殊處理后發(fā)生選擇性凋亡的淋巴細(xì)胞亞型。它還可用于活細(xì)胞的分類。
1、PBS溶液；
2、PI染色液：將PI溶解于PBS(pH7.4)中，終濃度為100ug/ml。儲存在棕色瓶中，4°C 避光保存。
3,70%乙醇4,400目篩5，流式細(xì)胞儀
1.收集細(xì)胞，500~1000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)基。
2.用3ml PBS洗滌一次。
3. 離心除去PBS，加入冰冷的70%乙醇固定，4℃固定1-2小時。
4. 離心棄固定液，重懸于 3ml PBS 中 5 分鐘。
5. 過400目篩一次，500-1000 r/min離心5 min，棄PBS。
6. 用1ml PI染色液染色，4℃避光30min。
7、流式細(xì)胞儀檢測：PI被氬離子激發(fā)產(chǎn)生熒光，激光光波波長為488nm，發(fā)射光波波長大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光，分析熒光直方圖PI的強(qiáng)度，并分析前向散射光到側(cè)向散射光的散射。圖片。
8.結(jié)果判斷：在前向散射光與側(cè)向散射光的散點(diǎn)圖或地形圖上，與正常細(xì)胞相比，凋亡細(xì)胞的前向散射光較低，而側(cè)向散射光可高可低，這與正常細(xì)胞相比，凋亡細(xì)胞的前向散射光較低，而側(cè)向散射光可高可低。細(xì)胞類型；在分析PI熒光直方圖時，首先使用門技術(shù)排除雙或聚集的細(xì)胞以及發(fā)出微弱熒光的細(xì)胞碎片。在PI熒光直方圖上，凋亡細(xì)胞在G1/G0期倍性峰之前出現(xiàn)一二二。例如，如果G1/G0期位置的熒光強(qiáng)度為1.0，則典型凋亡細(xì)胞樣品的亞二倍體峰的熒光強(qiáng)度為0.45，則可以使用雞和鮭魚紅細(xì)胞的PI熒光強(qiáng)度作為參考標(biāo)準(zhǔn)。 0.35 和 0.7，分別確保其間不是細(xì)胞碎片而是完整的細(xì)胞。
注：在細(xì)胞凋亡過程中，DNA 染色性的降低被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一，但這種 DNA 染色性的降低也可能是由于 DNA 含量的減少，或由于 DNA 結(jié)構(gòu)的變化所致。這是由于其與染料結(jié)合的能力發(fā)生變化引起的。分析結(jié)果時應(yīng)小心。
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