免疫測(cè)定的方法有哪些？

更新時(shí)間：2023-09-20 點(diǎn)擊次數(shù)：1818

利用抗原和抗體的特異性結(jié)合特性，通過(guò)免疫分析技術(shù)可以對(duì)細(xì)胞因子進(jìn)行定量或定性檢測(cè)。盡管細(xì)胞因子的種類很多，但只要獲得針對(duì)細(xì)胞因子的特異性抗體（包括多克隆或單克隆抗體），就可以采用免疫分析法進(jìn)行檢測(cè)。常用的方法包括ELISA、RIA、Western blotting、免疫熒光以及基于免疫熒光技術(shù)的流式細(xì)胞術(shù)分析。

1. 酶聯(lián)免疫吸附法

ELISA是應(yīng)用廣泛的異質(zhì)酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)。一步或多步抗原抗體反應(yīng)和一步酶促反應(yīng)構(gòu)成了ELISA的基本步驟，可用于定性或定量分析。雙抗體夾心法是細(xì)胞因子測(cè)定常用的方法。該方法中使用的抗體可以是針對(duì)同一抗原的多克隆抗體或針對(duì)同一抗原的不同表位的單克隆抗體。

細(xì)胞因子測(cè)定的標(biāo)本主要包括兩類，一類是血清（血漿）、滑液、胸水、腦脊液或腹膜液等體液，可用于細(xì)胞因子和可溶性粘附分子的檢測(cè)；另一種是體外培養(yǎng)后的細(xì)胞培養(yǎng)。上清液僅用于細(xì)胞因子的檢測(cè)。

ELISA方法具有特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、易于推廣和標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。此外，該方法還可以檢測(cè)無(wú)生物活性的細(xì)胞因子前體、分解片段以及與相應(yīng)受體的綴合物。缺點(diǎn)是靈敏度較低，無(wú)法判斷細(xì)胞因子的生物活性。

2. 流式細(xì)胞儀

流式細(xì)胞術(shù)是一種基于熒光抗體染色技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)靈敏分辨率的方法。該方法主要用于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子和細(xì)胞表面粘附分子的檢測(cè)。通過(guò)特異性熒光抗體染色，可以簡(jiǎn)單快速地進(jìn)行單細(xì)胞水平的細(xì)胞因子或粘附因子的檢測(cè)，并且可以準(zhǔn)確確定不同細(xì)胞亞群的檢測(cè)。細(xì)胞因子和膜分子的表達(dá)。根據(jù)熒光抗體的性質(zhì)，熒光抗體染色可分為直接法和間接法。前者使用熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子或粘附分子的特異性抗體，而后者則使用熒光標(biāo)記的二抗。直接法較為常用，雖然其靈敏度不如間接法，但特異性強(qiáng)。

該方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子時(shí)，主要包括以下基本步驟：

1. 待測(cè)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

2. 細(xì)胞固定常用的細(xì)胞固定液為4%多聚甲醛。

3. 封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn) 用含有 5% 脫脂奶粉和鈣、鎂離子的 PBS 溶液重懸固定的細(xì)胞。

4.染色與分析采用熒光素標(biāo)記的細(xì)胞因子特異性單克隆抗體進(jìn)行熒光抗體染色，流式細(xì)胞儀分析熒光陽(yáng)性細(xì)胞百分率和熒光強(qiáng)度。另外，如果使用兩種或多種細(xì)胞因子的不同熒光素標(biāo)記的單克隆抗體，則可以同時(shí)檢測(cè)同一細(xì)胞中兩種或多種不同的細(xì)胞因子。

該方法還可用于區(qū)分具有不同分泌特性的細(xì)胞亞群，例如 Th1 和 Th2 細(xì)胞。

3.酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT），源自ELISA，但突破了傳統(tǒng)ELISA，是抗體形成細(xì)胞定量測(cè)定的延伸和發(fā)展，已越來(lái)越多地應(yīng)用于類風(fēng)濕因子、IFN-γ等細(xì)胞因子的定量測(cè)定的分泌細(xì)胞。

ELISPOT優(yōu)于傳統(tǒng)的抗體、細(xì)胞因子或其他可溶性分子分泌細(xì)胞檢測(cè)方法，可以檢測(cè)20萬(wàn)至30萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中1個(gè)分泌相應(yīng)分子的細(xì)胞。如果引入生物素和親和素系統(tǒng)，則很敏感。做ELISPOT時(shí)，所選的特異性抗體應(yīng)具有高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素的特點(diǎn)。所選的細(xì)胞激活劑不得影響細(xì)胞的分泌功能。

4. 免疫測(cè)定的方法學(xué)評(píng)價(jià)
免疫測(cè)定可用于檢測(cè)幾乎所有細(xì)胞因子。與生物活性測(cè)定相比，主要優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)是：

優(yōu)點(diǎn)：①特異性高，使用特異性單克隆抗體可用于單一細(xì)胞因子的檢測(cè)； ②操作簡(jiǎn)單、快速，不需要依賴細(xì)胞系，因此不需要維持培養(yǎng)，大大增加了方法的可操作性，易于普及，便于普查； ③影響因素相對(duì)較少且易于控制，重復(fù)性好，方法易于標(biāo)準(zhǔn)化。

缺點(diǎn)：①測(cè)量的只是細(xì)胞因子的蛋白質(zhì)含量，與其生物活性不一定成正比； ②測(cè)定結(jié)果與所用抗體的來(lái)源和親和力有很大關(guān)系。當(dāng)使用具有不同親和力的mAb時(shí)，檢測(cè)到相同的樣品。結(jié)果可能會(huì)有所不同； ③靈敏度較低，比生物活性法低10～100倍左右，測(cè)定下限一般為100pg； ④ 如果樣品中存在可溶性細(xì)胞因子受體，可能會(huì)影響細(xì)胞因子特異性抗體的結(jié)合。

除了上述方法外，分子生物學(xué)技術(shù)（也是生物測(cè)定方法）也廣泛應(yīng)用于細(xì)胞因子或粘附分子的檢測(cè)，例如PCR/RT-PCR、斑點(diǎn)印跡、Northern-blot和FISH。細(xì)胞或組織原位雜交等

其他免疫分析：偏振熒光檢測(cè)技術(shù)；使用共焦激光顯微鏡；發(fā)光技術(shù)；免疫組織化學(xué)染色。這些方法在粘附分子、細(xì)胞因子及其分泌細(xì)胞的檢測(cè)中發(fā)揮著積極的作用。

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