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要成功地執(zhí)行 Duolink® PLA 實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案中有一些必要的考慮因素需要正確地準(zhǔn)備、設(shè)置和執(zhí)行。Duolink® PLA 產(chǎn)品可用于熒光和明場。熒光 Duolink® PLA 試劑可用于顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用。
一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
要設(shè)計(jì)一個(gè)成功的Duolink® PLA實(shí)驗(yàn)，必須考慮很多因素。這些因素包括但不限于：
1.確定蛋白質(zhì)靶標(biāo)和實(shí)驗(yàn)類型
2.選擇樣品（細(xì)胞或組織）
3.設(shè)計(jì)您的讀出方案
4.設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對照（技術(shù)和生物）
靶標(biāo)識(shí)別：
首先要確定的是目標(biāo)蛋白靶標(biāo)。是單一蛋白質(zhì)表達(dá)，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用 (PPI)，還是蛋白質(zhì)翻譯后修飾 (PTM)？下面簡要介紹了 Duolink® PLA 如何用于檢測各種類型的蛋白靶點(diǎn)。
單一蛋白表達(dá)的檢測：
檢測單個(gè)蛋白靶標(biāo)有兩種方法，即使用針對靶標(biāo)的一種一抗進(jìn)行單一識(shí)別或兩種一抗進(jìn)行雙重識(shí)別。
單一識(shí)別：
具有最高的靈敏度，建議在檢測低表達(dá)水平的單一蛋白質(zhì)靶標(biāo)時(shí)使用。也可用于雙重識(shí)別實(shí)驗(yàn)前對單個(gè)一抗?jié)舛鹊臏y定。但是，只有當(dāng)性能良好的特異性一抗可用時(shí)，才推薦使用此方法。由于測定的敏感性，使用非特異性一抗將導(dǎo)致高背景。
雙重識(shí)別：
通過使用兩種一抗提供了更高的特異性。每種一抗必須針對同一靶分子上不同的、非競爭性的表位。而且，這兩種一抗必須在不同物種（小鼠、兔或山羊）中培養(yǎng)，并且必須在相同的實(shí)驗(yàn)條件下與靶標(biāo)結(jié)合。這些條件在下面的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備部分中進(jìn)行了描述。
蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用檢測：
Duolink® PLA是檢測蛋白質(zhì)相互作用的方法。該方法使用兩種一抗來完成，每種抗體針對一種目標(biāo)靶標(biāo)，且在不同物種（小鼠、兔或山羊）中培養(yǎng)。兩種一抗必須在相同的實(shí)驗(yàn)條件下與靶標(biāo)結(jié)合。
蛋白質(zhì)與核酸的相互作用檢測：
蛋白質(zhì)-DNA 和蛋白質(zhì)-RNA 相互作用也可以通過使用修飾的原位雜交技術(shù)結(jié)合Duolink® PLA來進(jìn)行檢測。
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
為確保成功執(zhí)行 Duolink® PLA 實(shí)驗(yàn)，需要進(jìn)行大量準(zhǔn)備工作。這些準(zhǔn)備工作與傳統(tǒng)的 IF、IHC 或流式細(xì)胞術(shù)所需的工作類似。本節(jié)描述了一抗鑒定、樣品制備和抗體優(yōu)化的注意事項(xiàng)。
一抗的選擇：
Duolink® PLA試劑是使用二抗進(jìn)行靶標(biāo)特異性一抗檢測的通用試劑。設(shè)置 Duolink® PLA 實(shí)驗(yàn)時(shí)，一抗的選擇至關(guān)重要。
要求：
Duolink® PLA探針是驢抗小鼠、抗兔或抗山羊二抗；因此，對一抗有特定要求。這包括：
1.IgG 類
2.可以是單克隆或多克隆
3.優(yōu)選親和純化以使交叉反應(yīng)性最小化
4.建議使用 IF 或 IHC 驗(yàn)證
5.宿主必須是小鼠、兔子或山羊（特例情況要求使用Duolink® Probemaker）
直接偶聯(lián)一抗的使用：
有些情況下需要使用直接偶聯(lián)的一抗。Duolink® Probemaker能夠?qū)?PLA oligo (PLUS 或 MINUS) 偶聯(lián)到任何抗體上。使用 Duolink® Probemaker 的注意事項(xiàng)如下：
1.當(dāng)一抗的宿主不是小鼠、兔或山羊時(shí)
2.當(dāng)使用來自同一物種的兩種一抗時(shí)
3.當(dāng)使用在與組織樣品相同的宿主中產(chǎn)生的一抗時(shí)（例如，“小鼠一抗檢測小鼠樣品"）
一抗優(yōu)化：
為了成功執(zhí)行 Duolink® PLA 實(shí)驗(yàn)，確定待測樣品中最佳一抗性能的條件非常重要。一抗優(yōu)化的條件應(yīng)包括：
1.樣品處理（固定、透化和抗原修復(fù)）
2.一抗?jié)舛?/span>
3.阻斷溶液和抗體稀釋劑
下面介紹樣品處理、阻斷和抗體稀釋劑的具體注意事項(xiàng)。強(qiáng)烈建議首先通過 IF 或 IHC 染色鑒定一抗的條件。當(dāng)使用兩種一抗時(shí)，每種一抗的優(yōu)化應(yīng)分開進(jìn)行，但樣品處理需要兼容兩種一抗的最佳性能。
一旦 通過IF 或 IHC 確定了條件，這些條件就可以應(yīng)用于 Duolink® PLA。但是，Duolink® PLA 實(shí)驗(yàn)可能需要進(jìn)一步滴定一抗?jié)舛龋驗(yàn)榕c IF 和 IHC 相比，Duolink® PLA 具有更高的靈敏度和更放大的信號(hào)。使用上述Duolink® PLA單一識(shí)別方法可在優(yōu)化一抗?jié)舛葧r(shí)提供最高的靈敏度。這些條件可用于使用兩種一抗的 Duolink® PLA 實(shí)驗(yàn)。
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