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一、封閉
1.渦旋Duolink®封閉液。
2.在每個1cm2樣品上添加1滴（~40 μL）Duolink® 封閉液。確保封閉液要覆蓋整個樣品。
3.將載玻片置于加熱濕度箱中37℃孵育60分鐘。
二、孵育一抗在添加抗體之前請勿讓載玻片干燥，否則會導致背景。
1.渦旋Duolink®抗體稀釋劑。
2.在Duolink®抗體稀釋劑中稀釋一抗或抗體至合適濃度。
3.從載玻片上彈掉Duolink®封閉液
4.將一抗溶液添加到每個樣品中。
5.將載玻片置于濕度箱中孵育。用最佳孵育溫度和時間孵育一抗。
三、孵育Duolink® PLA探針
1.渦旋PLUS和MINUS PLA探針
2.在Duolink®抗體稀釋劑中以1:5稀釋PLUS和MINUS PLA探針。
對于40 μL反應，取8 μL PLA探針MINUS原液，8 μL PLA探針PLUS原液和24 μL抗體稀釋劑。為所有樣品制備足量的溶液。
3.從載玻片移除一抗溶液
4.在室溫下在1x洗滌緩沖液A中洗滌載玻片2x 5分鐘。
5.移除多余的洗滌緩沖液，然后涂抹PLA探針溶液。
6.將載玻片置于預熱的濕度箱37℃孵育1小時。
四、連接
說明：連接酶要等到需要添加到樣品中時立即添加。確保連接緩沖液在使用前解凍并充分混合。
1.用高純度純水以1:5稀釋5x Duolink® 連接緩沖液并混合。
對于40 μL反應，將8 μL 5x連接緩沖液添加到32 μL高純度純水中。為所有樣品制備足量的溶液。
2.從載玻片移除PLA探針溶液。
3.在室溫下在1x洗滌緩沖液A中洗滌載玻片2x 5分鐘。
4.在洗滌過程中，使用冷凍座（-20°C）恢復從凍箱里取出的連接酶。
5.以1:40稀釋度將連接酶添加到步驟（a）中的1x連接緩沖液中，并混合。
對于40 μL連接溶液，將1 μL連接酶添加至39 μL的1x連接緩沖液中。
6.移除多余的洗滌緩沖液，然后涂抹連接溶液。
7.將載玻片置于預熱的濕度箱37℃孵育30分鐘。
五、擴增
說明：聚合酶要等到需要添加到樣品中時立即添加。擴增緩沖液對光敏感。避免所有含有擴增緩沖液的溶液受到光照。
1.用高純度純水將5x擴增緩沖液以1:5稀釋并混合。對于40 μL反應，將8 μL 5x擴增緩沖液添加到32 μL高純度純水中。為所有樣品制備足量的溶液。
2.從載玻片移除連接溶液。
3.在室溫下在1x洗滌緩沖液A中洗滌載玻片2x 5分鐘。
4.在洗滌過程中，使用冷凍座（-20°C）恢復從凍箱里取出的聚合酶。
5.以1:80稀釋度將聚合酶添加到步驟（a）中的1x擴增緩沖液中，并混合。
6.移除多余的洗滌緩沖液，然后涂抹擴增溶液。
7.將載玻片置于預熱的濕度箱37℃孵育100分鐘。
六、最終洗滌
說明：光敏試劑。始終避免保存載玻片。
1.從載玻片上移除擴增溶液。
2.在室溫下在1x洗滌緩沖液B中將載玻片洗滌2x 10分鐘。
3.在0.01x洗滌緩沖液B中洗滌載玻片1分鐘。
七、準備成像
說明：含DAPI的Duolink原位封固劑是水性的，不會凝固?？捎酶蓛舻闹讣子兔芊馍w玻片和載玻片的邊緣。避免在蓋玻片下制造氣泡。
1.拍掉載玻片上多余的洗滌緩沖液。
2.使用最小體積的含DAPI的Duolink原位封固劑，用蓋玻片蓋好載玻片。
3.等待15分鐘，然后在熒光或共聚焦顯微鏡中分析，使用至少20x物鏡。
4.成像后，可將載玻片在黑暗中4°C下保存最多4天，或者在-20°C下保存最多6個月。
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