細菌保存指南：冷藏、冷凍和冷凍干燥

更新時間：2023-12-25 點擊次數：5569

在原種培養物、突變菌株和基因工程變體之間，任何一個實驗室可以積累的單個細菌培養物的數量可能很多。事實上，在設計一個質粒的過程中產生的變異數量可能是驚人的。大多數實驗室都會保留所有這些和其他變化，因為你永遠不知道明天可能需要什么。因此，保存所有這些細菌培養物和遺傳變異是需要深思熟慮的事情。

加蓋試管中的細菌培養物處于封閉環境中。盡管培養物開始時可能是健康的，但隨著時間的推移，活細胞的數量將減少到零。保存培養物的目的是降低死亡率，以便在重新進行培養物時，一些細胞仍然存活并可用于培養。細胞死亡的原因可能有很多，但在每種情況下都是基于細胞及其環境的固有化學性質。如果有害的化學反應可以減慢或停止，那么整個培養物將在更長的時間內保持活力。

有兩種基本方法可以減緩細菌培養物中有害反應的速度。第一個是降低溫度，從而降低所有化學反應的速率。這可以使用冰箱、機械冷凍機和液氮冷凍機來完成。第二種選擇是從培養物中去除水，這個過程可能很棘手，并且涉及使用凍干機升華水。

以下是保存細菌的主要選擇的簡要討論。報告了每個選項的優點和缺點。

冷藏

細菌在 4°C 下可以短暫存活。對于每天或每周使用的菌株，在瓊脂斜面或平板上生長的培養物可以儲存在冰箱中，前提是已采取預防措施以避免污染。應使用標準技術制備培養物，然后在儲存前密封。對于傾斜，我們建議使用螺旋蓋管。對于培養皿上的培養物，需要用封口膜密封培養皿。密封板不僅有助于防止霉菌潛入板中，而且還能減緩瓊脂的干燥速度。對于超過一周或兩周的情況，培養物可以以刺的形式儲存在小平底螺旋蓋小瓶中。在該技術中，小瓶中充滿少量瓊脂培養基（例如1ml）并滅菌。然后用無菌針將細菌引入固化的瓊脂中。將培養物用松蓋孵育過夜，然后用緊蓋保存在 4°C 下。儲存在刺棒中的培養物更能抵抗干燥和污染，但它們會比冷凍儲存更快地失去活力。刺傷可以保持活力的時間長度取決于應變。一些手冊聲稱刺針可以使用一年，但除非經過測試，否則做出這種假設是不明智的。刺傷可以保持活力的時間長度取決于應變。一些手冊聲稱刺針可以使用一年，但除非經過測試，否則做出這種假設是不明智的。刺傷可以保持活力的時間長度取決于應變。一些手冊聲稱刺針可以使用一年，但除非經過測試，否則做出這種假設是不明智的。

冷凍

冷凍是儲存細菌的好方法。一般來說，儲存溫度越低，培養物保留活細胞的時間越長。冷凍柜可分為三類：實驗室冷凍柜、超低溫冷凍柜和低溫冷凍柜。儲存在冰箱中的細菌（和其他細胞）面臨的問題是冰晶。冰會因局部鹽濃度增加導致脫水而損害細胞。當水轉化為冰時，溶質積聚在殘留的游離水中，這種高濃度的溶質會使生物分子變性。冰也會使細胞膜破裂，盡管這個問題通常與缺乏細胞壁的細胞有關，例如培養的動物細胞。為了減輕冷凍的負面影響，甘油經常被用作冷凍保護劑。許多魚類和昆蟲都會產生甘油，通過降低細胞的冰點、增強過冷以及防止結冰來抵御寒冷的溫度。對于細菌，添加甘油至終濃度 15% 將有助于保持細胞在所有冷凍條件下存活。以下是每個冷凍機類別的一些具體信息。

實驗室冷凍柜可以將溫度降低至 -20 至 -40°C。這些是單級系統（一臺壓縮機），通常稱為通用冷凍機。細菌可以在通用冰箱中保存中等時間，例如1年。最好使用沒有無霜溫度循環的冰箱，因為這會對細胞和其他溫度敏感的生物分子造成嚴重破壞。通用冰箱價格便宜，在大多數實驗室都有，因此它們很容易用于儲存培養物。缺點是它們的溫度不夠低，無法長期儲存。

超低溫冰箱是兩級系統（兩個壓縮機，每個壓縮機具有不同的制冷劑），可降至 -86°C 左右。超低溫冰箱非常普遍，但其中的空間有時可能有限且競爭激烈。超低溫冰箱的購買、運行和維護成本也高得多。好處是，儲存在 -80°C 下的細胞往往可以保持存活數年。超低溫冰箱產生的較低溫度大大減少了培養物內的化學反應。然而，冷凍細胞中仍然發生分子運動，因此培養物的活力將會下降。定期監測培養物以評估其生存能力非常重要。

低溫冷凍柜非常冷，依靠液氮或專門的機械系統來運行。對于生物樣品，低溫儲存應低于-130°C。在此溫度下，水的分子運動停止，細胞被困在玻璃狀基質中。儲存在低溫冰箱中的細菌可以保持其活力多年。在我們的實驗室中，細菌和酵母培養物已在 -140°C 下保存 15 年，活力沒有明顯喪失。與冷凍干燥相比，在低溫冰箱中儲存細胞是有效且簡單的長期儲存方法。其缺點是成本以及庫存對停電、機械故障和液氮交付失敗的潛在脆弱性。此外，管子切勿存放在浸沒液氮的罐中。螺旋蓋管泄漏，會將氮氣和污染物一起吸入管中。液氮氣相冷凍機將有效地避免這個問題，但這些冷凍機非常昂貴（高達1萬美元）并且需要大量液氮。另一種選擇是機械低溫冷凍機，溫度可低至 -150°C，但購買成本也非常昂貴（約 2 萬美元）。兩臺低溫冷凍機的運行費用每月為數百美元。但這些冷凍機非常昂貴（高達 1 萬美元）并且需要大量液氮。另一種選擇是機械低溫冷凍機，溫度可低至 -150°C，但購買成本也非常昂貴（約 2 萬美元）。兩臺低溫冷凍機的運行費用每月為數百美元。但這些冷凍機非常昂貴（高達 1 萬美元）并且需要大量液氮。另一種選擇是機械低溫冷凍機，溫度可低至 -150°C，但購買成本也非常昂貴（約 2 萬美元）。兩臺低溫冷凍機的運行費用每月為數百美元。

冷凍干燥

在水系統（例如活細胞）中，水不僅充當酶促反應的介質，而且還充當自發的負面反應（例如自由基形成）。除去水會停止酶促反應和非酶促反應。冷凍干燥是去除這種水的一種方法。通過冷凍干燥可以非常有效地保存許多細菌。通過將細胞冷凍在含有凍干保護劑（通常是蔗糖）的介質中，然后使用真空吸出水（升華），可以有效保存細胞。這種方法很費力，需要專門的設備，但它的優點是可以產生不受停電和空液氮罐影響的原種培養物。此外，如果培養物定期運送到其他實驗室，凍干培養物不需要特殊處理。冷凍干燥的缺點是并非所有培養物都以相同的方式反應，因此需要進行一些實驗來優化每種菌株的工藝。對于任何認真生產和維護培養物保藏的實驗室，冷凍干燥應作為主要的保存方法。