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該酪酰胺信號放大 (TSA) 方案可用于通過免疫染色或 原位雜交檢測過氧化物酶標記樣品中的信號。所有孵育均在搖床上進行。
2-4% 甲醛，pH 7.4
磷酸鹽緩沖液 (PBS)，pH 7.4
PBT：0.1% Tween-20； PBS，pH 7.4
1 mM 疊氮*鈉的 PBT 溶液
30 % H2O2
1 mg/ml熒光標記酪酰胺，標記 級 DMSO
可選：
硫酸葡聚糖 (DS)
4-碘苯酚
酸性甘氨酸緩沖液：0.1 M 甘氨酸； pH 2.0； 0.1% 吐溫-20
按要求的方式固定樣品。通常，用冷的 2-4% 甲醛（pH 7.4）進行固定。用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）和PBT （0.1% Tween-20；PBS，pH 7.4）清洗固定劑中的樣品。
通過將樣品在 抑制溶液（PBT 中的 1 mM 疊氮*鈉）中室溫孵育 30-60 分鐘來抑制內源過氧化物酶活性。
可選。可以使用 PBT 中的 3% H 2 O 2或 0.02 N HCl代替 1 mM 疊氮*鈉進行抑制。對于后續的免疫化學，該階段可以與阻斷抗體的非特異性結合相結合。為此，必須將封閉血清或 1% BSA 添加到疊氮化物或 H 2 O 2 溶液中。
筆記！如果背景較低且進行原位雜交，則可以跳過此步驟；直接進入步驟4。
在室溫下，在 PBT 中孵育 3 次，每次 10 分鐘，從抑制溶液中清洗樣品。
執行所有免疫化學或 原位雜交步驟，用過氧化物酶偶聯抗體標記樣品。
室溫下在 PBT 中孵育 3 次，每次 10 分鐘，清洗樣品以去除抗體。
使用前立即制備反應緩沖液。為此，用 30% H 2 O 2將 PBT 稀釋兩次，每次 1:100，直至最終濃度為 0.003% (1:10000)。
可選。為了提高方法的靈敏度，可以將以下組分添加到反應混合物中（單獨或組合）：
2% 硫酸葡聚糖 (DS) 用于增加反應混合物的粘度。
500 µg/ml 4-碘苯酚用于增強過氧化物酶反應。以 1:200 稀釋儲備液（100 mg/ml 乙醇溶液）使用更方便。
將 1 至 10 μg/ml標記的酪酰胺添加到反應緩沖液中（最佳濃度必須通過實驗確定）。通過搖動混合。
將樣品與反應緩沖液在黑暗中室溫孵育 5-30 分鐘（確切時間通過實驗確定；可以以 15 分鐘為起點）。
將樣品在抑制劑溶液（1 mM 疊氮*鈉的 PBT 溶液）中在室溫下避光孵育 10 分鐘來終止反應。
用 PBS 清洗樣品 3 次，每次 10 分鐘。
要重復抗體-TSA 標記周期，請在室溫下用酸性甘氨酸緩沖液（0.1% Tween-20；0.1 M 甘氨酸，pH 2.0）處理樣品 10 分鐘。該過程分離抗原結合的抗體，而不影響與蛋白質共價結合的酪酰胺。
使用封固劑將樣品封固在蓋玻片下 。
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