jenabioscience:Atto 425蛋白質標記試劑盒

Jena Bioscience由Max-Planck-Institute of Molecular Physiology(Dortmund)的一組科學家于1998年成立，利用超過25年的學術知識為100多個國家的研究和行業客戶開發創新試劑。

供一般實驗室使用。

運輸:凝膠包裝運輸

儲存條件:儲存在-20°C
避光儲存，參見手冊

保質期:12個月

光譜特性:
激發最大值:λexc= 436納米發射最大值:λ全身長的= 484納米消光系數:ε最大= 45000摩爾-1厘米-1校正系數:CF280納米 = 0.23

描述:
熒光技術已經成為生物科學的主要工具。熒光蛋白如GFP和DsRed融合到感興趣的蛋白(POI)允許表達分析和體內蛋白定位。然而，由于這些融合蛋白的大分子量，它們的應用受到限制。此外，相關的分子生物學是乏味和耗時的。
共價連接到POI上的小熒光團可能有助于克服這個問題。半胱氨酸巰基的熒光標記對于研究POI的結構、功能和相互作用是優選的。(請注意:Jena Bioscience提供了一個即用型試劑盒，用于用高質量的小熒光團標記半胱氨酸殘基(Cat。# FP-202)用于蛋白質活性和功能研究)。
然而，最常見的蛋白質標記方法是胺修飾。胺反應性熒光團如NHS-酯容易與N-末端[1]以及賴氨酸側鏈上的伯氨基反應，形成穩定的共價鍵。
這種Jena Bioscience蛋白質標記試劑盒設計用于用小熒光團標記POI的賴氨酸，產生熒光蛋白質-熒光團綴合物。它包含對1mg POI進行10次單獨標記反應所需的所有試劑。

內容:
atto 425 NHS-酯
1瓶含1毫克

二甲基甲酰胺
200微升

碳酸氫鈉
1瓶含84毫克

超純水
1毫升

儲存和穩定性:
收到后，將染料儲存在-20°c下。其他成分可儲存在室溫下。如果按照建議儲存，Jena Bioscience保證該產品在12個月內保持最佳性能。

協議:
一般注意事項
最佳蛋白質濃度為10 mg/ml，其他濃度也是可能的，然而，它應該至少為2 mg/ml，因為標記效率受到較低蛋白質濃度的影響。我們建議每個標記反應使用大約1毫克蛋白質。
含有伯胺如Tris和甘氨酸的緩沖液不適用于標記反應，必須在開始標記反應前用合適的不含胺的緩沖液如PBS、MES或HEPES替換。

實驗協議

• 加入1毫升超純水溶解碳酸氫鈉。得到的1 M溶液在4°C下至少穩定2周。
• 向蛋白質溶液中加入適量的碳酸氫鈉(1 M ),使最終濃度達到100 mM
• 通過添加100 μl DMF制備染料，使染料濃度達到10 mg/ml。渦旋直至NHS酯*全溶解！我們建議在使用前立即制備溶液，然而，它在-20°c下可穩定保存兩周。無論何時處理熒光團或共軛物，請在弱光條件下工作！
• 將100微升蛋白質溶液(10毫克/毫升)和10微升染料(10毫克/毫升)加入適當的小瓶中。小心渦旋并短暫離心，收集試管底部的反應混合物。
• 室溫下在搖床中培養一小時。避光！
• 使用標準凝膠過濾柱如Sephadex G-25或類似物純化綴合物。或者，可以通過透析或合適的自旋濃縮器將游離染料從綴合物中分離出來。

請注意，該套件不提供蛋白質純化材料！

共軛物的濃度
因為在標記過程中，特別是在純化過程中，可能會發生一定的蛋白質損失，所以測量綴合物的濃度對于進一步的應用是重要的。蛋白質的濃度通常通過測量其在280 nm處的吸光度來確定。然而，如Atto 425的激發光譜所示，熒光染料也在280 nm處吸收，從而增加了λ280對于共軛。因此，需要一個校正系數(CF)來消除280 nm處染料的影響。
每種染料的CF在光譜數據部分給出，因此綴合物的濃度根據下式計算:

c(毫克/毫升)= ((A280［構成動植物的古名或拉丁化的現代名］最大x CF) / ε280)x MW蛋白質

標記度
DOL表示每分子綴合物中熒光團分子的平均數。它是共軛物的一個重要參數，顯著地影響進一步的應用。對于大多數目的，每200個氨基酸大約1個熒光團分子的DOL是理想的，也參見故障排除部分。
DOL的計算公式如下:

DOL = (A最大x ε280)/ ((A280［構成動植物的古名或拉丁化的現代名］最大x CF) x ε最大)

測定用Atto 488 NHS酯標記的BSA(牛血清白蛋白)的結合物濃度和DOL的實例:
牛血清白蛋白:ε280= 42925米-1厘米-1，MW = 66，433 Da
Atto 488: λexc= 501納米，ε最大= 90，000米-1厘米-1，CF = 0.1

標記和純化后，分別在280和501 nm測量結合物溶液的吸收。

計算綴合物濃度和DOL:

c(毫克/毫升)= ((A280［構成動植物的古名或拉丁化的現代名］最大x CF) / ε280)x MW蛋白質
c(毫克/毫升)=((1.69-7.23 x 0.1)/42925)x 66433
c(毫克/毫升)= 1.5

DOL = (A最大x ε280)/ ((A280［構成動植物的古名或拉丁化的現代名］最大x CF) x ε最大)
DOL =(7.23 x 42925)/((1.69-7.23 x 0.1)x 90000)
DOL = 3.57

在該實驗中，綴合物的濃度為1.5 mg/ml，大多數蛋白質分子用三個或四個Atto 488分子標記，相當于每200個氨基酸有1.2個Atto 488分子。
請注意，結合物的濃度和DOL的光譜測定不是絕對正確的。游離染料的光譜特征與結合到POI的染料的光譜特征不全相同。此外，天然蛋白質在280 nm處的光譜特征不同于綴合物的光譜特征。
一般來說，這些變化小得可以忽略不計，因此，光譜測定結合物的濃度和DOL是*常用的方法[3]。
除了光譜測量之外，可以通過SDS-PAGE和隨后的凝膠熒光掃描來分析綴合物。在熒光掃描中應該只有一條帶(由熒光標記的蛋白質組成)可見。如果在非常低的分子量下有一個額外的帶，結合物溶液仍然含有游離染料，必須再次純化。

結合物的儲存
避光！像未標記的蛋白質一樣儲存結合物。我們建議將溶液分成小份，并在-20°C或-80°C下冷凍。避免反復冷凍和解凍！

故障排除:
低效標記

• 蛋白質溶液的濃度

  
  

  該分析被優化用于標記濃度為10 mg/ml的1 mg蛋白質。

  
  

  蛋白質濃度高于10毫克/毫升時，按比例增加染料量。如果您的蛋白質濃度非常低(< 1毫克/毫升)，請使用旋轉濃縮器以達到2毫克/毫升的最終濃度。

  
  

  標記的效率強烈依賴于濃度，并且在不同的蛋白質之間有所不同。因此，在每一種情況下，優化可能是必要的，以獲得所需程度的標記。
• 緩沖成分

  
  

  含有伯胺(甚至微量)的蛋白質溶液會顯著降低標記效率。確保你的蛋白質被充分透析，以防它與含胺物質接觸。
• pH值的影響

  
  

  檢查你的蛋白質溶液的pH值！參考范圍是8.2 - 8.5。

  
  

  蛋白質的伯氨基不能被質子化而具有活性，因此，蛋白質溶液的pH值必須足夠高。另一方面，NHS酯的水解速率隨著溶液的pH值而增加，導致非活性染料。最佳標記結果在pH 8.3獲得。

  
  

  在pH值較低的強緩沖蛋白質溶液中，100 mM碳酸氫鈉可能不足以將pH值提高到最佳值。您可以添加更多的碳酸氫鈉，直到達到最佳pH值。

注意，標記效率不僅取決于周圍條件，還取決于蛋白質特性。蛋白質表面的三級結構和由此產生的賴氨酸數量以及等電點和蛋白質在pH 8.3下的行為起作用。

過度標注
過度標記的原因可能是蛋白質表面的大量賴氨酸和/或蛋白質在pH 8.3時的最佳特性。
為了防止過度標記，減少染料量或增加蛋白質濃度。你也可以減少反應時間。

綴合物的純化
染料在水溶液中是不穩定的NHS酯的水解速率隨著溶液的pH值而增加。因此，在每次標記反應中都會產生一定量的游離染料，需要從綴合物中分離出來。
如果純化后的結合物仍然含有微量的游離染料，將其用于第二步純化。通過SDS-PAGE檢查結合物的純度。
在游離染料濃度較高時，從綴合物中分離游離染料變得更加困難。濃度非常高時，色譜柱或膜甚至會被染料堵塞，因此應盡量優化標記反應，以降低游離染料的濃度。請記住，總收率受到額外純化步驟的影響。

什么樣的DOL是優的？
作為一個基本規則，每200個氨基酸一種染料是理想的，然而，最佳的標記程度取決于你的蛋白質以及你的預期應用。如果您不確定，請使用不同劑量的少量結合物檢查您的分析，以獲得最佳結果。
在任何情況下都要防止過度標記，因為這可能導致蛋白質聚集或相鄰染料的熒光猝滅。

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