如何進行ELISA的構建？

更新時間：2024-01-22 點擊次數：1079

選擇您的關鍵試劑

固相：應選擇專門允許結合檢測中的抗原或抗體成分的固相以避免背景噪音。可用固相的例子有微孔板（通常是聚苯乙烯、聚丙烯和聚乙烯）、小管和珠子。小管和珠子通過提供較低的檢測限來擴展測定參數。這是因為它們允許靈活的測試數量和測定體積，同時還為涂層和反應的發生提供更大的表面積。珠子的使用可以進一步減少孵育時間，并使 ELISA 能夠用于不同的微流體系統，即自動化臺式 ELISA。珠子本身可以是磁性的，因此使用磁鐵可以輕松地將其分布在整個液相中。

樣本：

應選擇具有已知分析物濃度的標準樣品，以涵蓋從檢測下限到上限（校準）的整個測定范圍。這是為了確保無論樣品中可測量的分析物濃度較低還是較高，測定的靈敏度和精確度都是一致的。此外，患者樣本應取自并包含各種年齡范圍、種族、性別和健康狀況，以確保檢測的廣泛適用性和可靠的結果。在定量之前和定量過程中保持目標分析物穩定對于準確測定濃度至關重要。因此，樣品提取、制備和儲存中涉及的以下分析前條件尤其重要。

必須選擇能夠保持分析物穩定性的適當樣品基質。
可能需要將蛋白酶抑制劑添加到生物流體樣品基質中，以防止天然存在的蛋白酶降解分析物。
收集患者樣本時，必須評估運動、禁食、酒精、煙草和季節變化的影響。
必須確定最佳樣品儲存溫度（-80° C、-20° C、2-8° C 或室溫）和凍融循環次數
必須研究樣品在室溫下放置并在檢測環境中保持穩定的時間長度。
移液前必須以標準化方式充分混合或倒置樣品，以確保分析物在整個樣品基質中均勻分布。

洗滌緩沖液

洗滌緩沖液的目的是洗掉任何未結合或過量的物質，否則可能會產生背景噪音信號并干擾測定和結果。洗滌緩沖液的設計具有與生理條件相似的 pH 值和鹽濃度，并含有TRIS ( FT15751 )、PBS 和聚山梨酯等洗滌劑。如果檢測到大量“背景噪音"而不是信號強度，則增加洗滌緩沖液的體積、洗滌劑的濃度或/和洗滌步驟的數量通常會有所幫助。這將增加所有未結合材料被去除的可能性。如果懷疑分析物降解或者分析物在程序中被洗掉，則減少洗滌步驟數、洗滌緩沖液體積或緩沖液中去污劑的濃度可能是有益的。

封閉緩沖液

為了防止與其他檢測成分發生交叉反應和非特異性抗原結合，需要使用封閉劑。通常將牛奶溶液（脫脂奶粉）、全血清或牛血清白蛋白 (BSA) ( PRO-422 ) 等試劑添加到緩沖液中，并在第一次洗滌步驟后使用，以飽和孔的自由表面。

這種封閉緩沖液也可以含有去污劑，但應避免使用可能干擾測定的生物素或免疫球蛋白等成分。總體封閉緩沖液可以獲得更高的信噪比，并且可以在使用的封閉劑的體積、濃度和類型方面進行優化。

酶和底物（信號系統）

常用的信號系統之一是酶聯抗體，并且有多種不同形式和物種類型可供選擇。常用于 ELISA，其中堿性磷酸酶和磷酸對硝基苯酯底物在目標分析物存在的情況下會產生黃色。檢測抗體還可以與過氧化物酶并與氨基水楊酸和鄰苯二胺底物一起使用，如果出現陽性結果，它們會呈現棕色。總體酶反應用于證明反應的特異性和速率。信號出現后，可以添加氫氧化鈉、鹽酸或硫酸來終止反應。

在測定開發過程中，性能和財務方面在確定應使用哪些試劑以及濃度時起著關鍵作用。雖然使用較低濃度的酶聯抗體可能更具成本效益，但可能有必要增加濃度以確保產生足夠的信號強度。如果您的 ELISA 靈敏度較差，可以通過改變抗體類型（從單克隆抗體到多克隆抗體）或采用不同的信號系統來放大信號。第一個例子是二抗被生物素化，然后添加鏈霉親和素-HRP。由于四個鏈霉親和素分子可以與生物素相互作用，因此通過添加更多的鏈霉親和素分子進行檢測，可以提高檢測少量分析物的能力。此外，通過用多種酶、銀納米顆粒標記檢測抗體或使用化學發光或熒光底物等替代底物類型，可以提高靈敏度。

校準和控制

標準曲線或校準曲線由分布在測定范圍內的已知分析物濃度的樣品組成。它們在 ELISA 中用作輔助，以便稍后計算目標分子的濃度。應該強調的是，校準品和對照品的矩陣應盡可能與所運行的天然樣品的矩陣相似。

運行標準曲線很有用，如果生成的標準曲線較差，可能會導致結果無效或突出檢測中的錯誤。不正確的抗體結合或分析物捕獲可能是標準曲線不良的原因。除了校準曲線外，還應使用陽性和陰性對照樣品。陰性對照不應包含任何感興趣分析物的痕跡，因為它們用于檢查假陽性和非特異性結合。陽性對照應含有已知濃度的目標分析物。如果測定檢測到陽性對照中存在分析物并且陰性對照均為陰性，則測定工作可靠且結果有效。

使用已知濃度的校準品創建的 ELISA 標準曲線示例，X 表明通過曲線插值獲得的未知樣品的濃度。

培養箱和混合器

嘗試并使用 ELISA 的特定孵育時間和溫度，有助于在捕獲抗體和目標分析物之間達到結合平衡。控制板周圍溫度的一種方法是使用確保波動最小的培養箱。此外，使用混合器可以幫助您的 ELISA 達到最佳性能，因為它有助于將試劑分布在整個基質中，以促進更多的結合。一般來說，較長的潛伏期可能有利于靈敏度，因為有更多的時間進行結合。然而，還應該測試縮短的孵育時間。

捕獲抗體的固定化方法

當捕獲抗體固定到 ELISA 板上時，其方向可能會發生變化，從而降低其親和力以及與抗原結合的機會。此外，洗滌步驟中抗體的置換可能導致靈敏度和重現性較差。解決這個問題的一種方法是使用單層表面，使抗體能夠共價結合到板上，但 Tania García-Maceira 等人已經證明了靈敏度的更大改進。（2020）通過使用甲殼素涂層的聚苯乙烯表面來實現。使用這種固定形式，抗體通過與幾丁質結合域融合，以更好的方向被捕獲到微量滴定板上。